Homology modeling
前言
由蛋白質的胺基酸序列預測分子的三維結構是一大挑戰。目前預測蛋白質結構的方法可分成有同源模擬法(Homology
Modeling)、折疊辦識(Folding Recogition)、重頭起算法(AB initio)。
同源性模擬法(Homology modeling)又可以叫做比較性模擬法(comparative modeling)或是知識基礎模擬法(knowledge-base modeling)。應用這一個方法可以快速的模擬蛋白質的三維結構(3D structure)。目現已有一些人從事某些物種(species)的整個基因體蛋白質結構模擬。例如英國的xxx已模擬出酵母菌(yeast)的整個蛋白質結構。
同源模擬法(Homology Modeling)基本假設是蛋白質分子結構具有某種規則性，其可能三維結構的基本形態種類有限，各個形態是由幾種特定的胺基酸序列所構成。
合理的蛋白質分子模型必須滿足下列條件 :
1.可靠 ( reliable )
2.很容易和X光晶體學及多維度NMP光譜實驗數據相比。
3.和蛋白質分子現有之實驗觀測結果一致，並且和蛋白質分子結構的一般特徵相符。
4.提供足夠詳細的資料，以供分子結構和功能關係研究之用。
有了蛋白質分子三維結構的資料，建立合理的分子模型之後，將有助於分子結構和其功能關係之研究，例如有助於解釋指定位置之胺基酸更換實驗結果和實驗的設計，大輻縮減嘗試的時間。
蛋白質分子結構的特徵
蛋白質分子結構的特徵:
一級結構
蛋白質分子的胺基酸序列，
二級結構
分子骨幹(backbone)依其是否具有明顯規則的摺疊式樣來區分:螺旋，-摺片和轉折(turn)，不符合這三類的結構稱為線圈(coil) 。
超二級結構 ( supersecondary structure )
二級結構分子在三維空間內以特定的方式排列，構成較高層次結構的特徵，是由二級結構的堆積和整體能量因素來決定的。ex:Greek key motif
三級結構
一個或多個結構區域。結構區域是指蛋白質分子內一密集堆積的團狀部份，由單一分子鏈摺疊而成。
四級結構
由多個分子鏈各自構成的結構單位以特殊的排列方式構成具有特定生化功能的蛋白質分子結構。
蛋白質分子結構，
所有水溶性的團狀蛋白質都是密集堆積的結構，
=> 內部核心的胺基酸多半是厭水性
=> 外層由親水性的胺基酸序列包圍。
親水性和厭水性胺基酸序列排列的方式直接影響列蛋白質分子三級摺疊的方式。
團狀蛋白質分子可分成五類，
全a-螺旋，全b -摺片，a螺旋B摺片交替出現(a/b) ，a螺旋b摺片分別密集在分子中不同的區域(a+b) ，以及不屬於以上四項的結構。
團狀蛋白質分子的分子鏈拓樸關係可歸納為三個規則 :
相連的兩二級結構區域在形成三級摺疊結構時會互相接觸。
BXB的連接方式通常是符合右手定則。
含有二級結構元素之分子片段彼此不含交錯或形成繩結。
總結而論，
蛋白質分子的結構
由a螺旋和b摺片組成的結構單位以有限的方式堆積排列成較高層次的結構，這些結構進一步形成蛋白質分子的厭水核心，其中不含任何打折或伸展的分子片段，以及親水的外層部份。
同屬一系統(Family)
的蛋白質分子構造有相當程度的穩定性，不會因其中某些胺基酸的被取代或更改而有太大的改變，因此將兩具有相當序列相似(sequence homology)程度的胺基酸序列之一做若干胺基酸的更換或剛減，其分子結構上的類比(
stuuctural homology )關係仍然存在。
對照各分子的胺基酸序列可以發現，在同類蛋白質分子中都會出現的胺基酸序列片段常構成結構上維持不變的區域，而變異較大的對應序列片段則構成分子結構分子結構上差異的區域。
蛋白質分子核心部分的分子骨幹由二級構造密集堆積而成(不包含鬆散的分子鏈)。由於同一系統的蛋白質分子具有相同的三級摺疊式樣，在核心分子骨幹上其具有少量胺基酸的更換或差異，不會影響到三級摺疊的一般特徵，但會改變蛋白質分子若干物理化學特性，如核心部份是高度厭水性的。
同源模擬法預測蛋白質分子結構
它主要的方式是利用現存已解出的結構(可能由核磁共振(NMR)或是X光繞射(X-ray diffraction)所解出的結構)為模板，模擬出想要解的未知結構蛋白質序列 (protein sequence)。它詳細的方法列在下面。一般來說，當所要解的蛋白質序列(target protein)和模板(template)間的相似性越高，所模擬出來的結構正確性、可信度也就越高。
建立蛋白質分子模型的程度可分成六個步驟:
選擇參考蛋白質分子。
步驟(1)--選擇和目標蛋白質分子相關的參考蛋白質分子。
考慮兩個條件 :
目標分子和參考分子間序列相似的程度，
參考蛋白質分子已知結構的準確性。
若目標蛋白質分子所屬的系統中有一個以上的分子有已知結構，並且和參考分子的序列類比程度在25%以上時，一般而言可用同源性模擬方法得到目標分子的合理模型。
若沒有精確結構的蛋白質分子可供參考，或序列類比程度低於25%，以類比方法來建立蛋白質分子模型成功的機會就不高，此時需利用其他實驗數據的協助，例如 HIV-l( HIV-RT ) 中 reverse transcriptase， ( 反轉媒) 的 polymerase 區域，唯一已知結構的參考蛋白質是 E.Coli的 DNA polymerase ( Pol-I ) ，雖然兩者序列類比程度低於 25% ，但兩者具有極相近的功能而且由 affinity- labelling chemical modification 實驗中確認出關鍵的對應胺基酸lysine，提供重要的證據支持以 Pol-I 的結構做為建立HIV-RT模型的參考分子，因為目前只有Pol-I的a碳原子座標，因此HIV-RT模型的準確度受到Pol-Ia碳原子準確度的影響。
步驟(2)--比對目標和參考蛋白質分子的胺基酸序列。
這是整個程序中最關鍵性的步驟，對齊兩分子胺基酸序列即決定目標分子序列中對應於核心分子骨幹及鬆散分子鏈的各個段落，對產生正確三維結構有關鍵性的影響。
當序列相似程度大於50% 時，很容易將兩序列對齊。相似程度低於50%時，則需一些額外的資料才能得到可靠的對齊序列，困難之處在於確認序列中適當的基準點。這基準點必須都存在於參考和目標蛋白質分子標胺基酸序列之中，並具存在結構和功能上的重要性，這些基準點提供兩蛋白質分子正確的結構對應關係，找尋基準點的方法有幾種:
將參考及目標分子與同一系統內其他蛋白質分子序列排列比對，以各分子序列對應相同序列段落做為基準點
在對齊兩胺基酸序列時，只有在轉折 (turn ) 及鬆散分子鏈 ( 1oop ) 的區域內才可進行胺基酸段落的插入、刪除和更換，厭水性的胺基酸應限制在蛋白質分子核心部份的分子骨幹上。
步驟(3)--產生目標分子核心部份的分子骨幹。
利用參考分子的核心部份分子骨幹的結構為基礎，將胺基酸換成目標分子對應位置的胺基酸。
核心部份分子骨幹的胺基酸的更換只會政變二級結構元素的相對位置和取向，而不致於破壞這些結構元素或三級摺疊的一般特性，而且在這個區域要做的胺基酸插入或刪除的機會很小，修改後可再利用位能函數來調整各胺基酸的位置。為了避免造成分子核心部份分子骨幹結構的重大改變，這部份的修改是逐步進行的，一個一個胺基酸分別處理。在需要進行胺基酸插入或更換時，同時要決定該胺基酸支鏈部份的分子構形。做胺基酸更換時，被更換胺基酸支鏈部份的一個或多個扭角x的值是採用原參考分手對應胺基酸支鏈部份的對應扭角值，支鏈中其他部份的扭角值則由蛋白質結構資料庫中找尋最合理的值代人。在插入額外胺基酸時，胺基酸支鏈部份的所有扭角都要指定適當的數值，當所有原子都有指定的座標值之後，再以分子力學方法能量最小化程序消除可能的原子重疊的情況。
步驟(4)--產生鬆散分子鏈部份的結構，
兩種方法，
資料庫裏搜尋具有相同胺基酸序列的片段並借用其座標資料直接代人
利用能量能計算方法直接產生合理的原子座標。
資料庫搜尋的方法，能產生短分子鏈 ( 4-6 個胺基酸 ) 或由重複出現的基本結構式樣構成的中等大小的分子鏈之結構。適用範圍受限於蛋白質結構資料庫內已知結構的數量、種類和多樣性。小段的分子序列本身即具較小的分子構型空間，並且出現的機會較多，比較適合這種方法。
能量計算方法直接估算這分子片段可用的分子構形空間中重要的區域，以系統式或隨機式的程序進行分子構形搜尋，用這種方式可處理到長度為9的胺基酸序列，並且可產生和已知相似結構以外的分子構形，增加結構的多樣性。處理較長的分子鏈時，由於系統化的分子構形搜尋中各自由度排列組合產生極大的構形空間，能量計算方法需要很大的計算資源。為了降低計算量，這部份的計算可分成兩個階段，
第一個階段中先忽略不計胺基酸的支鏈部份 ( glycine 和 proline 的支鏈部份保留到B-碳原子為止 ) ， 即皆當作 alanine 處理，先在這分子骨幹的分子構形空間內做能量最小化計算，找到合理的分子骨幹構形後，
第二階段中將支鏈部份結構考慮進來，以能量最小化的方式計算各支鏈部分的分子構形。在做能量最小化計算時，為了考慮鄰近支鏈部份的影響，需將所有支鏈同時處理。為保證得到適當的低能量分子構形，可用模擬退火法 ( Simulated Annealing ) ，
因蛋白質分子較鬆散部份的分子鏈出現在分子的表層部份，在決定這部份分子構形時要考慮和溶劑分子的作用。
實際上，資料庫搜尋和能量計算方法是合併使用的。先由資料庫提供近似的結構再以能量最小化或分子運動方法做調整。在搜尋的過程中也可加人能量的計算以增加搜尋的效率。
步驟(5)--修正最後的分子結構。
在產生鬆散部份的分子鏈結構階段可能得到數個合理的分子構形，若不止一段的分子鏈各具有幾種可能的分子構形，則要考慮各段落分子構形的組合構形，再進行整體的結構調整和修正。若鬆散部份的結構來自資料庫，資料庫現存的資料可能無法適當代表可用的分子構形空間，因此要在這個階段利用分子運動學方法來修改分子結構，並借此辨出能量最低的分子構形。
步驟(6)--蛋白質分子結構的驗證
所建立分子模型的正確性必須和該蛋白質已知的實驗數據做一致性的比較來評估，例如溶劑分子的可接觸性，胺基酸堆積密度、厭水性或帶電荷或極性胺基酸的位置，分子靜電位場分佈和溶解自由能等等實驗測量值。另外用分子運動學方法來探測是否所得到的分子構形是停留在穩定的能量最小的區域或是停留在很淺的局部能量最小區域 ， 由 epitope mapping， site-specific mutagenesis， affinty-labelling chemical modification等實驗所得的實驗數據也有助於檢驗預測的分子模型是否合理，
以上這六個步驟是一個週期，一般而言需要反覆幾次的預測和校正檢驗的程序，最後才得到可靠的分子模型。
結論
同源性建模方法預測蛋白質分子的三維結構，有其限制:
1. 蛋白質分子中可供作參考的蛋白質結構及式樣的多樣性很有限。
2. 在同源性很低時，兩胺基酸序列比對，以及在鬆散分子鏈部份的三維
結構模擬都有待進一步改進和發展，
3. 在簡化位能函數及提供計算效率及處理溶劑效應方面仍有待努力。
應用:
此一個方法可以應用在蛋白質突變研究(mutation)，活性位置研究(active site)，藥物設計等。能夠減少在實驗上、製藥上所須的時間。
cf:重頭起算法(AB initio)。
先驗式的方法不使用已知蛋白質分子的結構資料，而是利用經驗式的位能函數，由計算組成原子間之各種相互作用，從原子的層次上模擬蛋白質分子在水溶液中之行為，利用能量最小化方法計算出合理的蛋白質分子三維結構。這方法的嚴重缺點是在分子的構型空間內存在多個能量較小值的狀態，由於分子系統的自由度太多，以致在分子構形的能量曲面上存在許多局部能量最小的分子構型。能量最小化方法本身不能保證找到全域的能量最小構型，因此必需加上其他輔助方法，如簡化修改位能函數，蒙地卡羅方法，模擬退火程序等等，以嘗試去克服多重最小值問題，這方面的改進和嘗試仍是活躍的研究課題，有待進一步發展。
Reference
1.蛋白質分子三維結構預測方法-類此方法 ( Homology )
簡介
原作者: Gerald M. Maggiora, S.Lakshmi
Narasimhan, Cindy A. Granatir, James R. Blinn,
Joseph B. Moon 改寫者: 何智雄
2.生物技術方法，卷四，生物資訊學徐源泰、楊永正
3. Nature Structural Biology 7, 986 - 990 (2000)
4. Annu. Rev. Biophys. Biomol.Struct. 2000. 29:291-325
5. http://www.cmbi.kun.nl/gvteach/hommod/index.shtml
6. http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html
